Sobre dinosaurios, rayos x, células inmortales e impresoras 3D.

Aunque las impresoras 3D no son una tecnología precisamente nueva (las primeras aparecieron en los años 80 del siglo pasado) estos últimos años estamos asistiendo a algo que sí es novedoso: su democratización. Y es que, un instrumento pensado originalmente para el ámbito industrial y con un precio muy elevado, está hoy en día al alcance de casi cualquier bolsillo. Hoy podemos comprar una impresora 3D desde 250€, algo más que razonable para un instrumento que nos permite materializar prácticamente cualquier cosa que podamos imaginar. Esta circunstancia está provocando tal entusiasmo que se la empieza a considerar como una de las tecnologías estratégicas del momento y no falta quien la considera ya incluso la siguiente revolución industrial.

La técnica que ha hecho posible la popularización de la impresión 3D se denominamodelado por deposición fundida, y se le ocurrió a su inventor, S.Scott Crump, cuando, jugando con su hija en la cocina se puso a fabricar para ella una rana de juguete utilizando una pistola de pegamento caliente. Junto con su mujer fundó en 1989 Stratasys que al poco tiempo se convirtió en la empresa líder en el sector industrial de este tipo de tecnología. La fase de popularización, no obstante, no comenzó hasta el año 2005 con la aparición del proyecto RepRap, una iniciativa de código abierto para diseñar una impresora 3D que fuese capaz de imprimir una gran parte de sus propios componentes. RepRap dio origen a la mayoría de las marcas de impresoras 3D destinadas al mercado general, entre otras MakerBot, que recientemente ha sido adquirida por Stratasys por la friolera de unos 400 millones de dólares.

3d printing with the Ultimaker (Foto: Elza van Swieten)

Todo este revuelo por una tecnología cuyo uso más extendido está siendo imprimir figuritas de plástico puede resultar difícil de entender. Pero la clave está en la democratización gracias a la cual la tecnología puede llegar a aquellas personas con la creatividad como para plantear aplicaciones insospechadas y con un alcance inimaginable. Aplicaciones que podrían ampliar las capacidades de los equipos de diagnóstico con rayos X y proporcionar nuevas herramientas en la investigación sobre la efectividad de las terapias contra el cáncer. Si no me creéis os invito a seguir leyendo.

‘Revivir’ a un Plateosaurus

La Dra. Schartz-Wings, encargada actualmente de mantener y poner orden en los fósiles del museo de historia natural de Berlín, tenía un curioso problema, un problema que comenzó hace mucho tiempo: el día 3 de febrero de 1945. Cuando quedaban meses escasos para que las tropas soviéticas desfilaran por Berlín, sobre el museo de historia natural, una de las joyas de la ciudad, llovían las bombas aliadas. Una de ellas cayó sobre el ala este del museo atravesando la colección de insectos del segundo piso, arrasando parte de la biblioteca y aterrizando finalmente en la sala de anatomía en la planta baja. Los grandes mamíferos y sus reconstrucciones fueron eliminados casi en su totalidad. Los cimientos se resintieron y toda el ala se derrumbó colapsando sobre el sótano. Sótano en el que se almacenaban fósiles valiosos como los restos Kentrosaurus (dinosaurio herbívoro que data del período Jurásico y que se estima que medía de 3,5 a 5 metros de longitud y que pudieron llegar a pesar 900 kg), que fueron destruidos. Afortunadamente algunos  esqueletos sobrevivieron a los bombardeos, junto con otros restos de diversa procedencia, muchos de ellos aún sin clasificar y, eso sí, mezclados con los escombros del edificio. El rompecabezas estaba servido.

La gran mayoría de los restos que sobrevivieron a la catástrofe no eran fósiles sino lo que se conoce como ‘piezas sin preparar’ pertenecientes a distintas excavaciones. Al extraer los restos de un yacimiento, para que se conserven mejor y evitar posibles daños durante el transporte, y antes de separar el fósil propiamente dicho del sedimento que lo rodea, era habitual forrarlos de yeso y tiras de arpillera. Las piezas sin preparar, por lo tanto, tienen la apariencia de pequeños bloques de yeso. Lo único que distinguía las piezas del museo de los escombros del edificio derrumbado eran las anotaciones realizadas sobre su superficie por los arqueólogos para clasificar los huesos fosilizados que contienen. Entre las piezas que acabaron mezcladas se encontraban las de dos excavaciones, las dos comenzadas en el año 1909 pero en lugares muy diferentes, una de ellas en África, en la actual Tanzania junto al monte Tendaguru, la otra bastante más cerca de Berlín, en Halberstadt, en el estado de Sajonia-Anhalt. Aunque el meticuloso trabajo de catalogación llevado a cabo por los excavadores mediante la anotación de los bloques y los dibujos y notas de campo, ha permitido distinguir a qué excavación pertenecen algunas de las piezas, el origen de muchas de ellas aún es dudoso.

Werner Janensch paleontólogo y geólogo alemán con su sombrero salacot en la excavación de Tendaguru

Y aquí está el problema: una colección de bloques de yeso pertenecientes a dos excavaciones distintas completamente mezcladas y que hay que clasificar. El complejo y delicado proceso de extracción mecánica de los huesos que hay en el interior de los bloques, picando el yeso y el sedimento fosilizado que rodea al hueso fósil, y que permitiría clasificarlos, podría llevar años. Eso sin contar con la pérdida de información sobre el proceso de fosilización y el riesgo de destrucción de de los fósiles que las técnicas convencionales conllevan.

¡Rayos X al rescate! A escasos minutos del Museo de Historia Natural de Berlín se encuentra el Hospital Charité Campus Mite. La Dra. Schartz-Wings no tarda en ponerse en contacto con la Dra. Ahi Sema Issever, jefa del servicio de radiología del hospital. La idea es escanear las piezas dudosas para observar lo que hay en su interior y clasificarlas con ayuda de los dibujos de campo. No es una idea nueva, la tomografía computarizada se utilizó por primera vez en paleontología el año 1979 y actualmente es una herramienta de gran valor que ha dado lugar a un nuevo campo de investigación: la paleorradiología.

Dra. Ahi Sema Issever, jefa del servicio de radiología del Hospital Charité Campus Mite (Berlín).

Así que, sobre la camilla del TAC, esta vez, no tenemos un paciente sino una de las piezas del museo, un objeto con la apariencia de un bloque de yeso, del tamaño de una caja de zapatos y de unos 5 kg de peso.  La imagen se obtiene con un equipo Aquillon ONE de Toshiba de 320 cortes y revela que la muestra sin preparar guardaba en su interior una vértebra dorsal de Plateosaurus. El Plateosaurus fue un dinosaurio sauropodomorfo, presumiblemente omnívoro de cuello largo y que podía llegar a alcanzar hasta 10 metros de longitud. Se trata de un dinosaurio muy común en centroeuropa, en localidades del sur de Alemania, Suiza, y en Halberstadt. Una comparación con los dibujos de campo realizados durante las excavaciones confirmaron que la ubicación original del fósil era la excavación de Halberstadt.

Plateosaurus es un género de dinosaurios prosaurópodos plateosáuridos, que vivieron a finales del período Triásico, hace aproximadamente 214 y 204 millones de años, en el Noriano, en lo que hoy es Europa y Groenlandia (Wikipedia).

Imagen digitalizada del mapa de campo original de la excavación de Halberstadt, 1923. En el inserto detalle magnificado de la vértebra fosilizada identificada.

Reconstrucciones coronal (A, B) y sagital (C, D) del hueso fósil con diferentes valores de ventana de visualización. En la vista coronal se aprecia claramente la diferencia de atenuación entre el material fósil y el recubrimiento de yeso (marcado con un asterisco).

La cosa podría haber terminado aquí,  pero la Dra. Issever pensó que con un poco más de trabajo podrían llegar mucho más lejos, podrían, de hecho ‘recuperar’ el hueso fósil del interior del bloque. El primer paso para ello es lo que se denomina segmentación de la imagen que es como técnicamente se denomina al análisis de la imagen que se realiza para extraer regiones que correspondan a distintos materiales. Este es el trabajo fino, lo que permitirá la separación virtual del hueso de todo lo que lo rodea. El objeto presentaba principalmente dos valores diferenciados de atenuación, lo que quiere decir que podía diferenciarse claramente, con facilidad, dos materiales bien distintos en el bloque: el material fósil y la capa protectora de yeso y arpillera (figura imagen A y C). Cuando existe una diferencia tan clara la separación puede realizarse de forma automática estableciendo umbrales asociados a los distintos niveles de atenuación. Separar el hueso fósil del sedimento fósil que lo rodeaba fue una tarea mucho más complicada debido a que sus valores de atenuación son muy similares y existe una gran incertidumbre sobre todo en los vóxels que pertenecen a la frontera de los dos materiales. El proceso de segmentación de esta última etapa fue esencialmente manual, mediante inspección visual, y no automático.

Reconstrucción virtual 3D de la vértebra fosilizada tras separarla del sedimento y la capa protectora de yeso.

Ya casi hemos terminado, tenemos virtualmente separado el hueso fósil, ¡ya solo quedaba darle al botón imprimir! Bueno, casi. Un último paso de procesado de la imagen era ineludible, aquel en la que se eliminaron todos aquellos artefactos que la hacían imposible de imprimir como por ejemplo los picos de ruido en la superficie .Para esto se involucró al Laboratorio de 3D del Instituto para el desarrollo de las matemáticas de la Universidad de Berlín  que fueron también los que aportaron la impresora. El resultado final puede verse en la foto.

Impresión 3D junto a la muestra sin preparar original en el interior de la cual se encuentra el fósil.

Todo este trabajo, meticulosamente descrito, se ha publicado en la revista Radiology: Reviving the dinosaur: Virtual Reconstruction and Three-dimensional Printing of a Dinosaur Vertebra. El propio editor de la revista, Herbert Y. Kressel, lo ha calificado como uno de los más emocionantes e inspiradores de los publicados hasta el momento este año (2014) y ciertamente, al leerlo parece más una novela de aventuras que una publicación científica. Los autores defienden que se trata de un trabajo pionero y no de una mera curiosidad y afirman que la técnica que plantean podría ser de gran utilidad. Destacan además su velocidad en comparación con las técnicas de  extracción convencionales y que se trata de un método no destructivo que permite conservar la pieza original.

El eterno retorno de Henrietta Lacks: ¿Y si cambiamos la tinta? ¿Y si imprimimos un tumor?

El 8 de febrero de 1951 a Henrietta Laks se le realizó una biopsia con el fin de obtener células del cáncer uterino del que acababa de ser diagnosticada, con fines de investigación  y sin su conocimiento o consentimiento; esto es algo que ahora puede resultar chocante pero que era completamente normal en aquella época. Sesenta años más tarde las células cancerosas de Henrietta Laks, conocidas como células HeLa, siguen reproduciéndose y su uso en la investigación del cáncer está muy extendido.

Cuando se desarrollan nuevos agentes moleculares para su uso como radiosensibilizadores, por ejemplo, la evaluación inicial de su eficacia se realiza en cultivos celulares. Estos cultivos consisten en placas de petri con un medio adecuado para el desarrollo de las células y son esencialmente bidimensionales, es decir las células crecen sobre un plano, formando capas. Sobre estos cultivos pueden estudiarse distintos efectos (o end points), como la inhibición de la proliferación celular y la formación de colonias tras la irradiación con y sin exposición a un determinado fármaco. Por diversos motivos, los efectos que observemos in vitro no serán siempre trasladables a lo que se observará in vivo. Entre otras cosas, no pueden conseguirse las mismas concentraciones de fármaco in vivo que in vitro, las condiciones del cultivo pueden influir de forma significativa la supervivencia celular y muchos factores microambientales que están presentes en los tumores no están presentes en los cultivos. Todo esto podría cambiar gracias a las impresoras 3D.

En su artículo Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro, publicado en abril de este año (2014), en la revista Biofabrication, Yu Zhao y el resto de autores describen la aplicación de técnicas de impresión 3D para reconstruir modelos in vitro de tumores con células HeLa sobre una estructura de hidrogel. Los autores miden la proliferación celular, la expresión de determinadas proteínas y la quimioresistencia en modelos de tumor de cérvix imprimidos y lo comparan con los modelos convencionales de cultivos bidimensionales. Han observado que las células HeLa muestran una mayor tasa de proliferación en el ambiente tridimensional y tienden a formar agrupaciones esferoides mientras que en los cultivos bidimensionales se forman monocapas. Las células HeLa en los modelos 3D muestran además una expresión mayor de la proteína MMP, relevantes en la participación de procesos como la angiogénesis y la metástasis de células tumorales, y mayor quimiorresistencia que aquellas en cultivos 2D.

Quimioresistencia de las células Hela en la matriz 3D y el cultivo 2D. (B) Actividad metabólica celular tras tratamiento con paclitaxel en los cultivos 2D y 3D. *** significa p < 0.001; t-test.

Secreción de MMP por las células Hela en los cultivos 2D y 3D. * significa p < 0.05; t-test.

Estas características biológicas de los modelos 3D así como la novedosa tecnología de impresión puede resultar de gran ayuda en el estudio de la biología de los tumores reales y suponer un avance importante en la investigación de los efectos de distintas terapias. Además, el desarrollo de los procesos de impresión 3D hará, en breve, posible el ensamblamiento de células con diferentes fenotipos, permitiendo así la construcción de modelos tridimensionales in vitro para simular el microambiente celular heterogéneo.

Referencias

Schilling R, Jastram B, Wings O, Schwarz-Wings D, Issever A S. Reviving the Dinosaur: Virtual Reconstruction and Three-dimensional Printing of a Dinosaur Vertebra. Radiology. Vol. 270. Num. 3 (2014) 864-871
Zhao Y, Yao R, Ouyang L, Ding H, Zhang T, Zhang K, Cheng S, Sun W. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. Num. 6 (2014)
Joiner M C, van der Kogel A. Basic Clinical Radiobiology. CRC Press (2009)